Диагностика дифтерии: современные методы

Для диагностики дифтерии разработаны различные методы: бактериологический, биологический, иммунохимический (РПГА, ИФА, РКоА, РЛА), также проводятся молекулярно-биологические исследования (ПЦР, риботипирование, энзимотипирование, секвенирование ДНК).

Крайне важны правильное взятие и своевременная доставка материала, а также четкий учет результатов.

Современная лабораторная диагностика дифтерийной инфекции имеет большое значение для установления диагноза, принятия решения о проведении специфической терапии, оценки и прогнозирования эпидемиологической ситуации.

Культуральный метод

Бактериологический или культуральный метод является основным и используется с диагностической, профилактической и эпидемиологической целями.

Проведение бактериологического исследования на обнаружение возбудителя дифтерии регламентировано и осуществляется в соответствии с методическими указаниями «Лабораторная диагностика дифтерийной инфекции».

Результаты бактериологического исследования в значительной степени зависят от своевременного и правильного забора материала, качества питательных сред, четкого и профессионального выполнения.

С диагностической целью в стационаре обследуют больных с острыми воспалительными заболеваниями в ротоглотке и дыхательных путях при подозрении на дифтерию ежедневно в течение 3 дней; при амбулаторном обследовании — больных ангинами, имеющих патологические выпоты на миндалинах, больных с подозрением на паратонзиллит, заглоточный абсцесс, стенозирующий ларинготрахеит, инфекционный мононуклеоз. Материал берут однократно.

По эпидемиологическим показаниям обследуются лица, бывшие в контакте с источником инфекции. Забор материала у них проводится однократно.

С профилактической целью обследуют лиц, поступающих в детские дома, специальные учреждения для детей с поражением ЦНС, санатории для детей с туберкулезной интоксикацией, в психоневрологические стационары — однократно.

Бактериологическое обследование бактерионосителей токсигенных штаммов С. diphtheriae проводят двукратно.

В период реконвалесценции после завершения антибактериальной терапии обследование проводят через 3 дня после окончания лечения, дважды с интервалом в одни сутки.

Взятие и доставка материала

Материалом для исследования служат слизь, отделяемое и пленки из ротоглотки и носа. При наличии налета взятие материал производится с границы пораженной и здоровой ткани.

При подозрении на экстрабуккальные формы дифтерии проводят забор из очагов поражения (глаз, ухо, кожа, влагалище и др.), также следует брать материал из носа и зева. От больных материал должен быть взят в течение 3-4 ч (не позднее 12 ч) с момента поступления в стационар до назначения антибактериальной терапии.

При обследовании здоровых лиц на дифтерийное бактерионосительство исследуют слизь из зева (миндалины, дужки) и носа (нижние носовые ходы).

Для взятия проб используют стерильные ватные сухие тампоны. Исследуемый материал из каждого локуса забирают отдельным тампоном. Фибринозную пленку можно снять пинцетом.

Доставка материал в лабораторию осуществляется в течение 3 часов, в холодное время года, предохраняя от охлаждения.

При проведении обследования контингентов в отдаленных от бактериологических лабораторий районах, когда посев не может быть проведен в течение 3 ч, материал засевают у постели больного на транспортную полужидкую среду с теллуритом калия.

При использовании транспортной среды тампоны с материалом погружают в среду. Допускается инкубация посевов на транспортной среде до 18-20 ч, после чего делают высев на плотные питательные среды.

Культивирование материала на тампоне в транспортной среде, используемой в качестве среды обогащения, позволяет повысить показатель высеваеваемости коринебактерий дифтерии и применять иммунохимические методы для выявления токсина, использование которых сокращает сроки выдачи предварительного ответа.

С другой стороны, культивирование исследуемого материала на транспортной среде свыше 8 ч может способствовать размножению не только коринебактерий, но и сопутствующей микрофлоры, в частности S. aureus и S. epidermidis, соответственно более 90 и 10 % штаммов которых обладают теллуритредуктазой.

Тест Элека

Для выделения возбудителя дифтерии проводят прямой посев материала, взятого сухим ватным тампоном или тампоном после культивирования в транспортной среде, на одну из элективноселективных сред для коринебактерий дифтерии.

В настоящее время предпочтение отдается кровяным теллуритовым средам. Все среды, используемые для первичного посева и последующей дифференциации выделенной культуры, подлежат предварительному контролю.

Через 24 часа инкубации на кровяных теллуритовых средах формируются колонии, окрашенные в черный или темно-серый цвет. Замедленное формирование подозрительных колоний (через 48 ч) в основном выявляется при исследовании материала, взятого у бактерионосителей.

Признаки, характерные для колоний биоваров gravis, mitis и intermedius, проявляются через 48 ч. Просмотр колоний осуществляют с помощью микроскопа бинокулярного стереоскопического (МБС).

В случае обнаружения подозрительных на коринебактерии дифтерии колоний их сразу же исследуют на токсигенные свойства. Необходимо изучать токсигенные свойства у нескольких колоний, т. к. из исследуемого материала могут быть выделены одновременно токсигенные и нетоксигенные клоны клеток коринебактерий дифтерии.

Для определения токсигенности используют тест Элека (традиционный или модификационный), основанный на методе встречной иммунодиффузии токсина и антитоксических антител (антитоксина) в специальных питательных средах (среда для определения токсина дифтерийного микроба или коринетоксагар) и являющийся одним из вариантов постановки реакции преципитации в геле.

При постановке теста Элека делают посев по 1\2 каждой из 2 изолированных колоний на среду для определения токсигенности и необожженной петлей — уколом в столбик среды Пизу; другую половину колонии отсевают в пробирку со скошенным 10% сывороточным агаром, из оставшихся нескольких 5-7 колоний формируют бляшки.

В случае множественного роста подозрительных колоний проводят определение уреазной активности в пробе Заксе. При обнаружении только одной колонии ее засевают на среду для определения токсигенности и, не обжигая петлю, в среду Пизу для определения цистиназы.

После учета результатов для дальнейшей идентификации используют культуру со среды Пизу или из бляшки.

У выросшей на сывороточном агаре культуры изучают морфологию, используя метод окраски по Леффлеру, биохимические свойства (глюкоза, сахароза, мальтоза, крахмал, декстрин), определяют уреазную активность.

При необходимости идентифицировать С. ulcerans используют тесты на уреазу и восстановление нитратов в нитриты.

Диф-диагностика и гиподиагностика дифтерии

Определение токсина является основным дифференциально-диагностическим тестом при бактериологическом исследовании на дифтерию.

Клиническое и эпидемиологическое значение токсигенных и нетоксигенных штаммов различно, поэтому чрезвычайно важно как можно быстрее получить точные данные о токсигенности штаммов, чтобы подтвердить диагноз дифтерии и воспрепятствовать распространению инфекции путем выявления бактерионосителей среди контактных лиц.

Критерием оценки специфичности преципитатов служит время появления и расположение линий преципитации испытуемого штамма по отношению к линиям преципитации контрольного токсигенного штамма. Специфические линии преципитации появляются через 24-48 ч, сливаются или направлены на слияние с линиями контрольного штамма.

Метод преципитации является высокоспецифичным, но его чувствительность составляет 0,5-1,0 мкг/мл по белку антигена. В связи с этим у штаммов коринебактерий дифтерии с низким уровнем продукции токсина специфические линии преципитации могут формироваться гораздо позже.

В практических лабораториях возможна гиподиагностика при определении токсигенности дифтерийных бактерий, что в основном обусловлено нестандартными питательными средами, повышенным содержанием железа в сыворотке, добавляемой в среду, недостаточными посевными дозами и малым содержанием антитоксина на бумажных носителях, а также другими отклонениями от методики постановки теста.

Одной из причин гиподиагностики при определении токсина методом иммунодиффузии является повышенное содержание железа в сыворотке лошади или крупного рогатого скота, которая является обязательным компонентом, добавляемым в среду для определения токсина дифтерийного микроба или коринетоксагар.

У токсигенных штаммов С. diphtheriae способность экспрессировать ДТ, а также интенсивность роста и размножения наблюдаются при малых концентрациях железа, что объясняется снижением потребности в источнике железа у токсиген-ных штаммов С. diphtheriae.

Экспрессия структурного tox-гена, носителем которого является профаг, находится под контролем хромосомного регуляторного гена dtxR. Ген dtxR является ответственным за синтез железо-зависимого белка-репрессо-ра dtxR.

В операторе гена tox имеется участок ДНК, с которым взаимодействует белок-репрессор, препятствуя транскрипции tox-мРНК и, следовательно, продукции дифтерийного токсина. При дефиците железа белок-репрессор инактивируется и начинается синтез токсина.

Неспецифические линии преципитации при определении токсина могут быть выявлены в основном при использовании лечебной антитоксической сыворотки или препаратов нестандартного антитоксина, содержащих антитела к клеточным антигенам С. diphtheriae.

Выявление цистиназной активности, способности окислять глюкозу и мальтозу, отношение к крахмалу, декстрину и отсутствие фермента уреазы наряду с характерными морфокультуральными признаками (полиморфизм, метахроматичное окрашивание, формирование колоний черного или серого цвета на кровяных теллуритовых средах) позволяют отнести выделенный микроорганизм к С. diphtheriae и одному из биоваров.

Выделенный в результате бактериологического исследования штамм C.diphtheriae является возбудителем дифтерии, если он обладает токсигенными свойствами.

Бактериологический метод диф-диагностики дифтерии позволяет в случае выделения токсигенного штамма, обладающего цистиназной активностью, дать окончательный документированный ответ через 48-72-96 часов, нетоксигенного штамма — через 72-96 часов.

Использование высококачественных питательных сред для первичного посева, определения токсигенности, биохимических свойств и микроскопа бинокулярного стереоскопического (МБС) для отбора колоний позволяет ускорить проведение бактериологического исследования и, соответственно, сократить сроки выдачи ответа до 48 часов.

Методы определения токсина

Определение токсина у возбудителя дифтерии является основным дифференциальным тестом при диагностике дифтерии.

Для определения токсигенных свойств коринебактерий дифтерии разработаны и могут быть использованы разные методы, которые значительно различаются по специфичности, чувствительности и времени проведения исследования.

Основной метод определения токсина — иммунодиффузия в агаре — является высокоспецифичным, но позволяет выявлять ДТ только у 84,0 и 80,4 % штаммов, выделенных от больных и бактерионосителей соответственно.

Это связано с наличием у положительных в ПЦР и отрицательных в тесте Элека штаммов «молчащего» гена токсигенности. Роль таких штаммов в патологии пока неясна.

Биологические методы определения токсигенности, основанные на использовании 9-дневных куриных эмбрионов, перевиваемых культур клеток, пробах на вирулентность на морских свинках или кроликах, являются высокочувствительными, но трудоемкими и дорогостоящими.

Наиболее надежным тестом для определения токсина in vivo является подкожный тест на вирулентность на морских свинках.

Микробиология диагностики дифтерии: иммунохимические методы

При диагностике дифтерии комплексное микробиологическое исследование с использованием иммунохимических (РЛА, РКоА, РПГА, ИФА) методов позволяет значительно повысить эффективность лабораторной диагностики дифтерийной инфекции, ускорить обнаружение токсина.

Методы не являются обязательными при проведении диагностики дифтерии, но, по сравнению с традиционным (метод Элека), имеют преимущества по чувствительности и времени проведения анализа.

Современные варианты иммунохимического анализа, использование моноклональных антител к эпитопам дифтерийного токсина гарантируют и их высокую специфичность. Результаты, полученные этими методами, позволяют дать только предварительный ответ о наличии токсина.

Реакция пассивной гемагглютинации (РИГА) и иммуноферментный анализ (ИФА) могут быть использованы для выявления слаботоксигенных штаммов C.diphtheriae, определения уровня токсинопродукции, а также с целью сокращения сроков выявления ДТ.

Токсин обнаруживается в РИГА через 18 часов после посева культуры в жидкую питательную среду, содержащую сыворотку и теллурит калия, и через 3 ч при использовании бульона на основе сред 199 или «Игла» с 20 % сыворотки крупного рогатого скота.

Для проведения ИФА можно использовать культуру и непосредственно надосадок среды культивирования исходного клинического материала. Реакции являются высокочувствительными, и при их использовании токсин определяется в 98 % случаев.

Постановка РИГА основана на использовании эритроцитарного дифтерийного диагностикума, сенсибилизированного поликлональными антитоксическими антителами (антитоксином), способными взаимодействовать только с дифтерийным токсином.

При наличии в исследуемом образце токсина образуется специфический комплекс (ДТ—АТ), который выявляется в виде агглю-тината эритроцитов. Для постановки РПГА необходимо использовать стабильные стандартные диагностикумы, чувствительность которых не ниже 0,003 Lf/мл.

Метод позволяет определять относительное содержание токсина, умножая значение чувствительности диагностикума, выраженного в единицах Lf/мл, на обратное значение титра исследуемой пробы.

Для определения дифтерийного токсина методом ИФА разработан твердофазный вариант «сэндвич». В микробиологии тест-системы ИФА пдля диагностики дифтерии используют моноклональные антитоксические противодифтерийные антитела (МкАт) к концевому участку В-фрагмента дифтерийного токсина, адсорбированные на поверхности полистироловых планшет.

Адсорбированные на поверхности полистирола МкАт взаимодействуют с эпитопами В-фрагмента ДТ, если он присутствует в исследуемой пробе. К комплексу МкАт—ДТ добавляют конъюгат (К), представляющий собой поликлональные антитоксические антитела, конъюгированные с ферментом (пероксидаза хрена).

Свободные эпитопы ДТ взаимодействуют с поликлональными антитоксическими антителами, входящими в состав конъюгата, образуется комплекс МкАт—ДТ—К, который обнаруживают, добавляя смесь перекиси водорода с индикатором.

Результаты реакции учитывают визуально или с использованием спектрофотометра. Использование Fab-фрагментов МкАт гарантирует высокую чувствительность тест-системы. Метод позволяет определять токсин в концентрации 0,8-1,5 нг/мл или 0,0002 Lf/мл анатоксина и используется как в варианте «скрининг», так и для количественного определения ДТ.

Разработан метод определения ДТ на мембранах эпителиоцитов слизистой оболочки больных с помощью ИФА. С этой целью используют тест-систему «Дифтерия-монозим», в которую входят моноклональные антитела к СООН-концевой части В-фрагмента молекулы ДТ.

Данный метод позволяет выявить в течение 5-6 ч даже незначительное количество токсина, адсорбированного на мембранах клеток слизистой оболочки больных в 100 % случаев, провести раннюю дифференциальную диагностику дифтерии с клинически схожими заболеваниями.

РЛА и РКоА являются экспресс-методами обнаружения ДТ в культуральной жидкости.

Разработана аналитическая система для реализации экспресс-способа диагностики токсигенных штаммов, в которую входит дифтерийный латексный диагностикум и микроридер со сменными чипами.

Дифтерийный антительный диагностикум получен путем химической сорбции на поверхности полиакриламидных латексных частиц высокоавидных антитоксических антител с индексом авидности не менее 90 %.

Постановку РЛА осуществляют на чипах, результаты фиксируют в заданном или произвольном режиме в памяти компьютера в виде фотоизображений. Разработанный способ обладает высокой эффективностью, количественная оценка чувствительности метода составляет 0,001 Lf/мл.

В настоящее время большинство иммунохимических методов определения дифтерийного токсина могут применяться только в лабораториях научно-исследовательских учреждений, в которых они разработаны, т. к. соответствующих тест-систем производственного выпуска не существует.

Иммунологические методы

Основным показателем напряженности противодифтерийного иммунитета является уровень дифтерийного антитоксина в сыворотке крови.

Для определения уровня антитоксина в сыворотке крови вакцинированных и больных используют иммунологические методы (РПГА, ИФА, методы Ремера и Йенсена, реакция нейтрализации токсина в клеточной культуре Vero).

Реакцию нейтрализации in vivo на морских свинках по Ремеру или на кроликах по Йенсену считают универсальными методами, или «золотым стандартом» определения антитоксических антител в сыворотке крови человека. Результаты реакции нейтрализации по Йенсену в 100 % случаев совпадают с результатами теста Элека.

Иммунологические методы могут быть полезными при необходимости дифференциации стертых и атипичных форм дифтерии и неспецифических ангин с сопутствующим носительством токсигенных штаммов.

Реакция пассивной гемагглютинации (РПГА) отличается высокой специфичностью и чувствительностью и является регламентированным методом для изучения напряженности противодифтерийного иммунитета.

Это двухкомпонентная сложная реакция, при которой противодифтерийные антитела, находящиеся в исследуемой сыворотке, взаимодействуют с дифтерийным анатоксином, который адсорбирован на эритроцитах.

В результате специфического взаимодействия антитоксических антител с анатоксином образуется комплекс, выявляемый в виде агглютината эритроцитов. За условно-защитный титр противодифтерийных антитоксических антител принимается титр 1:20. Существует и мнение, что нет четко определенного «защитного титра» антител, определяемого в этой реакции.

Результат РПГА подтверждается в реакции торможения пассивной гемагглютинации (РТПГА), реакция оценивается специфичной при снижении титра антител в РТПГА в 4-8 раз и более.

Реакцию нейтрализации (PH) на кроликах по Йенсену проводят с целью количественного определения антитоксина в крови больного. Метод основан на способности ДТ вызывать воспалительную реакцию и некроз при внутрикожном его введении кроликам.

In vitro исследуемую сыворотку смешивают с различными дозами стандартного токсина и затем вводят кроликам. Отсутствие или степень выраженности внутрикожной реакции зависит от количества антитоксина, содержащегося в крови больного.

С помощью метода Йенсена можно дифференцировать стертые и атипичные формы дифтерии от ангины другой этиологии с сопутствующим носительством токсигенных штаммов. Исследование крови проводят в первые 3-5 дней от начала заболевания.

Отсутствие антитоксина или его низкий уровень (менее 0,01 МЕ/мл) является доводом в пользу заболевания. Уровень антитоксина 0,5-1,0 МЕ/мл свидетельствует в пользу бактерионосительства.

Резкий подъем антитоксина у больных может быть обусловлен вторичным иммунным ответом в случае, если больной вакцинирован, что необходимо учитывать при оценке реакции. Определение титра антитоксина с диагностической целью проводят только до введения лечебной сыворотки. Метод Йенсена применяют редко, т. к. он остается трудоемким и дорогостоящим.

Соответственно рекомендациям ВОЗ для определения уровня антитоксина в сыворотке используют и реакцию нейтрализации токсина в культуре клеток Vero (перевиваемая культура клеток почек обезьян).

Дифтерийный токсин подавляет метаболическую активность и рост культуры клеток Vero. Тест основан на нейтрализации цитотоксического действия ДТ антитоксином, который содержится в сыворотке крови.

Реакцию нейтрализации проводят в микропланшете, в лунки которого с последовательно разведенной исследуемой сывороткой крови вносят ДТ в рабочей дозе и культуру клеток Vero, инкубируют в течение 5-6 дней при 37 °С.

Определение титра антител к дифтерийному токсину проводят по выявлению живых клеток культуры Vero или спектрофотометрически по снижению степени окрашиваемости субстрата митохондриальной дегидрогеназой.

При иммунном ответе на дифтерийный токсин или анатоксин в крови обнаруживаются лимфоциты (1,00-5,71 %), специфически связывающие эти антигены. Определение лимфоцитов, специфически связывающих дифтерийный токсин или анатоксин, проводят в реакции смешанного розеткообразования.

С этой целью в качестве контроля используют эритроциты, сенсибилизированные столбнячным анатоксином, что позволяет дифференцировать антигенсвязывающие лимфоциты (АСЛ) дифтерийной специфичности, обусловленной дифтерийной инфекцией или вакцинацией.

Обнаружение АСЛ дифтерийной специфичности и отсутствие АСЛ столбнячной специфичности является основным критерием для постановки диагноза дифтерийной инфекции.

Вакцинация дифтерийным анатоксином практически всегда осуществляется в комплексе со столбнячным, а иммуногенная активность последнего в АКДС и АДС больше, чем дифтерийного, поэтому в случаях, когда выявление АСЛ дифтерийной специфичности обусловлено вакцинацией, всегда будут обнаружены АСЛ и столбнячной специфичности.

В случае дифтерийной инфекции (заболевание или носительство), наоборот, выявляются АСЛ только дифтерийной специфичности.

Метод количественного определения токсина в составе циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) разработан для ранней диагностики дифтерии и иммунологического мониторинга в процессе лечения.

Для постановки метода используют сыворотку крови больного, из которой с помощью полиэтиленгликоля осаждают ЦИК и исследуют в иммуноферментной реакции согласно инструкции по применению «Дифтерия-монозим». ДТ в составе ЦИК обнаруживается в широком диапазоне концентраций: 0,45-22,3 Lf/мл.

Сроки обнаружения ДТ в ЦИК и его уровень имеют корреляцию с длительностью симптомов интоксикации и развитием осложнений дифтерийного процесса, что является важным для прогнозирования тяжести течения дифтерии и оценки эффективности терапевтических мероприятий.